3 июня 1566 г. Мария удалилась в личные покои Эдинбургского замка. После убийства Риццио она опасалась за свою безопасность и настояла, чтобы граф Аргайл, который, как она полагала, будет защищать шотландскую монархию до последней капли крови, несмотря на ссоры с ней самой и с ее матерью, поселился в соседней комнате и не покидал ее ни днем ни ночью. Сын Марии, принц Джеймс, родился в среду, 19 июня между десятью и одиннадцатью утра. Роды были долгими и трудными. Тем не менее Мария не утратила чувства юмора, в самый разгар родов воскликнув, что если бы она знала, как будет больно, то никогда не вышла бы замуж.
Появившийся на свет ребенок был абсолютно здоров. Мария торжествовала, хотя сил у нее почти не осталось. Она родила законного наследника престола для своей страны — сделала то, что ожидали от женщины-правительницы. Это значительно усилило ее позиции в противостоянии с Елизаветой, у которой от этой новости испортилось настроение. Пушки Эдинбургского замка дали залп в честь рождения наследника, и начались спонтанные празднования. В Эдинбурге и пригородах жители зажгли более пятисот костров.
Два дня спустя Киллигрю навестил Марию в ее покоях. Он поздравил ее с благополучным разрешением от бремени, а королева поблагодарила посла и извинилась, что разговор будет коротким. Она все еще была в постели, и у нее болела грудь. Из-за слабости она говорила очень тихо, и ее голос все время прерывался гулким кашлем. Киллигрю провели в детскую и показали ребенка. Джеймс, как выразился посол, повторяя своего предшественника Садлера, восхищавшегося маленькой Марией, был «прекраснейшим ребенком». Сначала Киллигрю посмотрел, как мальчик «сосет грудь кормилицы», Маргариты Литтл, а затем увидел младенца «обнаженным, я имею в виду голову, руки и ноги, и насколько я могу судить, это будет пропорционально сложенный и здоровый принц».
В XVI в. роды бывали опасным для жизни событием, и женщины всегда готовились к худшему. 9 июня Мария созвала приближенных, чтобы продиктовать завещание. Были сделаны три копии: одну следовало отправить ее родственникам Гизам, вторую она оставила себе, а третью подписала, запечатала и отдала тем, кого в случае ее смерти назначат регентами. Ни одна из этих копий не сохранилась. Мы знаем лишь, что функции регента должен был исполнять коллективный орган. Дарнли не был включен в его состав или (что более вероятно) его присутствие уравновешивалось двумя независимыми регентами, одним из которых был лорд Эрскин, умеренный протестант и капитан Эдинбургского замка, которому Мария пожаловала титул графа Мара. Другой член регентского совета — полностью реабилитированный граф Аргайл. Впоследствии враги Марии утверждали, что Мария назначила регентом Босуэлла, что явно не соответствовало действительности. Несмотря на то что отчаянный граф возвысился в ее глазах, он все еще оставался противоречивой фигурой, чей буйный нрав и любовь к дуэлям делали его менее подходящим для защиты интересов ее семьи и монархии, чем Мар и Аргайл. Но и Мар, и Аргайл ненавидели Дарнли. Он пришел в ярость: условия завещания Марии возмутили Ленноксов. Киллигрю предположил, что их склонность к заговорам только усилится.
У завещания имелось приложение, в котором указывалось, кому достанутся драгоценности Марии, и это приложение сохранилось. На шестнадцати потертых и подпорченных водой листах большого формата перечислены 250 предметов, и против каждого на полях указано имя человека, которому отписывается этот предмет. Список составляли Мария Ливингстон, одна из четырех Марий, отвечавшая за драгоценности королевы, и Маргарита Карвуд, любимая фрейлина Марии. Записи на полях сделаны рукой самой Марии. Почерк неаккуратный, даже для нее. На последних месяцах беременности она несколько раз жаловалась на судороги, хотя почерк ее и так постепенно портился.
Мария написала, что это приложение к завещанию вступит в силу, если и она, и ее ребенок умрут. Она понимала, насколько близок может быть ее последний час, и неровный почерк, вероятно, отражал ее психологическое и физическое состояние. Список явно указывает на то, чем были заняты ее мысли, потому что в числе получателей наследства большинство составляли не шотландские лорды и муж, а ее родственники Гизы. Мария прожила в Шотландии больше пяти лет и, должно быть, часто чувствовала себя одиноко, поскольку так и не забыла своих связей с Францией. Впоследствии даже коротенькая записка из Франции доставляла ей удовольствие, а когда она получала письма от родственников, у нее на глазах выступали слезы радости. Из почти шестидесяти человек, присутствовавших в списке наследников, четырнадцать были из семьи Гизов. В первую очередь Мария думала о них — они шли вторыми после шотландской короны и получали львиную долю самых дорогих и роскошных предметов. Например, великолепная коллекция рубинов, жемчуга, брошей, воротников, золотых цепей, серег, а также пояс с золотой пряжкой и драгоценными камнями переходили в вечное владение семьи.