Во время этой поездки в Калугу ослабевший во время поста отец Амвросий подхватил тяжелую простуду, давшую осложнение на желудок. Со временем состояние его здоровья ухудшилось до такой степени, что в декабре 1847-го он вынужден был просить оставить его за штатом - то есть жить в монастыре, не выполняя при этом определенных обязанностей. Освидетельствовавший его врач записал, что «отец иеромонах Амвросий имеет болезненный желтый цвет лица, с болезненно-блестящими глазами, всеобщую худобу тела, при высоком своем росте и узкой грудной клетке - сильный, больше сухой кашель, с болью при нем в груди; боль в подреберных сторонах, преимущественно в правой, нытье под ложкой и давящую боль в стороне желудка; совершенное расстройство пищеварения <...> бессонницу и, наконец, повременный озноб к вечеру, сменяющийся легким жаром. Припадки эти означают медленную изнурительную лихорадку». Эта болезнь так и не оставила его до конца дней. Она то утихала, то вновь обострялась, временами причиняя отцу Амвросию невыносимые страдания. Но он не только никогда не скорбел о своем недуге, но считал его даже полезным для духовного совершенствования.
Отправление за штат вовсе не подразумевало, что в монастыре отец Амвросий сидел без дела. Еще в августе 1846-го, во время визита в Оптину епископа Калужского и Боровского Николая, владыка прямо велел Амвросию «помогать отцу Макарию в духовничестве». Эта помощь и стала его главным послушанием. Нет сомнения, что старец Макарий уже тогда высоко ценил духовные дарования своего ученика и видел в нем полноправного преемника. Но не забывал и смирять его. Например, видя, что отец Амвросий присел, тяжело дыша и явно страдая от болезни, он тут же повышал на него голос:
- Амвросий, Амвросий! Что ничего не делаешь?!
Некоторые из братий, жалея Амвросия, напоминали отцу Макарию о болезненном состоянии отца иеросхимонаха. На это старец отвечал:
- А я разве хуже тебя знаю? Но ведь выговоры и замечания монаху - это щеточки, которыми стирается греховная пыль с его души, а без сего монах заржавеет.
А сам умел тем временем и утешить ученика. Например, мимоходом совал ему баночку варенья: «На-ко тебе для услаждения гортани от горести!»
По поручению старца отец Амвросий начал духовно окормлять некоторых из братий, а затем и мирских посетителей. К ним он ходил в монастырскую гостиницу, причем обычно нес на спине мешок со свежими рубашками и чулками (из-за болезни он страдал сильной потливостью и вынужден был часто переодеваться). Отец Макарий, проходя мимо, иногда грозил ему палкой, приговаривая: «Посмотрите-ка, Амвросий-то у меня хлеб отнимает!» Но это была, конечно же, шутка.
7 сентября 1860 года отец Макарий ушел из жизни. Отцу Амвросию в эти дни было так плохо, что он даже одеться не смог, не то что пойти на похороны... Сразу после ухода старца наступила неопределенная пора в жизни иеросхимонаха. Настоятель пустыни, архимандрит Моисей, избрал своим духовным отцом не Амвросия, а своего младшего брата, игумена Антония, прочая же братия исповедовалась у общего духовника, скитоначальника иеромонаха Пафнутия (Осмоловского, 1808-1891). Отец же Амвросий окормлял лишь немногих молодых монахов и мирян, причем некоторые из них, хорошо помнившие Макария, относились к его сравнительно молодому (48 лет) преемнику чуть ли не с пренебрежением («Как! - говорила одна барыня. - Чтобы я после Макария пошла к этому монаху, который все вертелся в батюшкиных келиях и расхаживал с мешочком! Это невозможно».). Но 1862 год все расставил по своим местам. В этом году скончался маститый настоятель Оптиной, схиархимандрит Моисей (Путилов). На выборах нового настоятеля голоса разделились - большая часть братии голосовала за иеромонаха Пафнутия, меньшая - за иеромонаха Исаакия (Антимонова, 1810-1894). Узнав об этом, отец Амвросий отправился к епископу Калужскому и Боровскому Григорию (Миткевичу, 1807-1881) и заявил о том, что старец Макарий при жизни назначил преемником настоятеля именно Исаакия. Этот аргумент сыграл решающую роль, и новым настоятелем стал Исаакий, чьим духовным отцом был Амвросий. Отношения между ними установились самые добрые, и впоследствии отец Исаакий говорил: «Двадцать девять лет провел я настоятелем при Старце и скорбей не видал».